發布時間：2026-03-19
摘要
目的:天然產物（NPs）歷來是藥物研發的核心來源。然而天然產物結構復雜，精準確定其生物活性成分及作用靶點仍面臨巨大挑戰。本研究建立一種創新的天然產物虛擬篩選 - 相互作用 - 表型（NP VIP） 研究策略，整合虛擬篩選、化學蛋白質組學與代謝組學技術，用于天然產物生物活性靶點的鑒定與驗證。該方法可降低假陽性結果，提升靶點鑒定效率。
方法：本研究以對缺血性腦卒中（IS）具有明確治療潛力的中藥丹參（Salvia miltiorrhiza，SM）為例，展示該策略的完整流程。通過虛擬篩選、化學蛋白質組學、代謝組學分別篩選得到丹參治療缺血性腦卒中的潛在靶點29 個、100 個、78 個。經 NP VIP 策略進一步分析，最終確定5 個高可信度靶點，包括：多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 1（PARP1）、信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）、淀粉樣前體蛋白（APP）、谷氨酸 - 氨連接酶（GLUL）及谷氨酸脫羧酶 67（GAD67）。后續驗證實驗證實，這些靶點在丹參的神經保護作用中發揮關鍵作用。
結論：本研究不僅證實丹參在缺血性腦卒中治療中的重要價值，更為天然產物研究提供了可推廣的整合式研究范式，該方法可廣泛應用于其他藥理學探索。
關鍵詞：NP VIP 策略；靶點鑒定；天然產物；丹參
核心內容
本研究提出的天然產物虛擬篩選-相互作用-表型標準工作流程主要包括以下關鍵步驟：
天然產物的提取與表征：以丹參為例，通過75%乙醇提取、硅膠柱色譜分離，并結合超高效液相色譜-串聯質譜和全球天然產物社會分子網絡等技術，對丹參提取物的化學成分進行了全面分析，共鑒定出151種化合物，這是迄今最全面的丹參化學成分表征之一。
藥效驗證：通過體外PC12細胞的氧糖剝奪/復糖復氧模型和體內大鼠大腦中動脈閉塞模型，證實了丹參提取物對缺血性腦卒中具有顯著的神經保護作用，包括提高細胞活力、維持鈣穩態、保護線粒體結構、減少腦梗死體積和改善神經功能評分。
虛擬篩選：利用丹參已知的化學成分，通過基于結構相似性（如SwissTargetPrediction）和生物活性相似性（如Chemical Checker平臺）的工具進行靶點預測。整合兩種方法的結果，并與疾病數據庫（DisGeNET）中缺血性腦卒中相關靶點取交集，最終獲得29個高置信度潛在靶點。進一步的富集分析、蛋白互作網絡分析和分子對接揭示了這些靶點參與的通路（如炎癥反應、花生四烯酸代謝）以及核心蛋白（如APP、STAT3）。
化學蛋白質組學分析：采用蛋白質組積分溶解度改變方法，這是一種基于細胞熱遷移測定的簡化方法，用于識別與丹參提取物直接結合的蛋白。將細胞裂解液與丹參提取物孵育后，施加溫度梯度處理，通過質譜鑒定和定量熱穩定性發生變化的蛋白。共篩選出100個差異蛋白，其中86個熱穩定性顯著增加，包括在虛擬篩選中也鑒定到的APP。這些蛋白富集于自噬通路和突觸后膜等功能。
多劑量代謝組學分析：對經不同濃度丹參提取物處理后的細胞進行非靶向代謝組學分析。通過分析隨劑量變化的代謝物，推斷其上游或下游的代謝酶靶點。共鑒定出82個劑量依賴性變化的代謝物，關聯到78個代謝酶靶點。例如，發現丹參提取物可能通過影響谷氨酸-氨連接酶和谷氨酸脫羧酶67調節谷氨酸和γ-氨基丁酸的水平，從而緩解興奮性毒性。
核心發現與驗證
通過整合虛擬篩選、化學蛋白質組學和代謝組學的分析結果，并結合生物信息學分析，本研究篩選出五個高置信度靶點進行實驗驗證：
聚ADP核糖聚合酶1
信號轉導和轉錄激活因子3
淀粉樣前體蛋白
谷氨酸-氨連接酶
谷氨酸脫羧酶67
采用藥物親和力響應靶點穩定性技術結合Western blot實驗證實，丹參提取物能夠以劑量依賴的方式增強這五種蛋白抵抗蛋白酶消化的能力，表明丹參中的活性成分與這些蛋白存在特異性結合。進一步的分子對接和分子動力學模擬（圖9E）也驗證了丹參中特定化合物（如芹菜素與APP、 Salvianolic acid C與PARP1等）與這些靶點蛋白之間的穩定結合。
討論與總結
本研究成功展示了天然產物虛擬篩選-相互作用-表型策略在識別天然產物（丹參）治療復雜疾病（缺血性腦卒中）的多靶點機制方面的有效性。該方法整合了計算模擬、直接相互作用驗證和表型相關分析的優點，彌補了單一方法的不足，顯著提高了靶點發現的準確性和效率。通過該方法識別并驗證的五個靶點——聚ADP核糖聚合酶1、信號轉導和轉錄激活因子3、淀粉樣前體蛋白、谷氨酸-氨連接酶和谷氨酸脫羧酶67，在缺血性腦卒中的病理過程中（如細胞死亡、凋亡、應激反應、興奮性毒性等）均扮演著關鍵角色，為丹參的神經保護作用提供了新的分子機制見解。該研究不僅為丹參的臨床應用提供了重要依據，也為其他復雜天然產物的藥理學研究提供了一個可借鑒的綜合范式。盡管存在將混合物視為整體而難以明確特定成分-靶點關系的局限性，但結合分子對接和動力學模擬等手段可在一定程度上進行彌補，未來亦可整合表面等離子體共振和超濾液質聯用等技術進行更深入的探究。
未來研究
一、明確成分-靶點對應關系
當前將丹參提取物作為整體分析，難以確定具體化合物與靶點的對應關系。后續可利用表面等離子體共振等技術，對PARP1、STAT3等核心靶點與丹參單體進行一對一結合驗證。
二、解析多靶點協同機制
通過基因編輯技術逐一敲除靶點，評估各靶點在神經保護中的貢獻度，揭示PARP1、APP等靶點間的信號串擾網絡。
三、拓展方法應用
將NP-VIP策略應用于黃芪、人參等其他天然產物，研究其在神經退行性疾病、腫瘤中的作用機制。
文獻推薦
IF6.1
1.YP-Ab-10859科研原料-PARP-1 Polyclonal Antibody
2.YP-Ab-02054科研原料-Stat3 Polyclonal Antibody
3.YP-Ab-12871科研原料-Amyloid-β Polyclonal Antibody
4.YP-Ab-12846科研原料-Gl Syn Polyclonal Antibody
5.YP-Ab-12726科研原料-GAD67 Polyclonal Antibody
